Die zweite Auflage eines Standardwerks: Alle wichtigen Aspekte und Techniken der Elektrophorese werden abgedeckt, von SDS-PAGE und Isotachophorese bis zu isoelektrischer Fokussierung, blauer Nativ-Elektrophorese und zweidimensionalen Methoden. Speziell auf die Bedürfnisse von Laboranten und technischen Angestellten zugeschnitten, stehen praktische Gesichtspunkte und Methoden im Mittelpunkt des Buchs. Nach einem Überblick über alle gängigen Elektrophoresetechniken mit einer Einführung in Detektion, Musterauswertung und Proteomik folgen Kapitel zu Instrumentierung und benötigten Arbeitsmaterialien. Detaillierte Methodenanleitungen erleichtern auch dem Anfänger den praktischen Einstieg in die Welt der Elektrophorese. Die Begleitwebsite mit zahlreichen Animationen ermöglicht einen zusätzlichen visuellen Zugang zu den einzelnen Techniken.
Reiner Westermeier war nach seiner Promotion und Post-Doc Zeit an der Technischen Universität München 30 Jahre lang als Spezialist für Elektrophorese bei führenden Firmen für Bioanalytik- und Biotechnologie tätig. Sein Aufgabengebiet umfasste die Entwicklung neuer Methoden und Geräte, das Schreiben von wissenschaftlichen Artikeln und Anleitungen, Problemlösungen beim Anwender, die Durchführung von Seminaren und Praxis-Kursen auf dem Gebiet der Elektrophorese und der Proteomik, sowie das weltweite Halten von Vorträgen. Er ist Herausgeber und Autor mehrerer erfolgreicher Bücher, wie z.B Electrophoresis in Practice (in deutsch und in englisch), Proteomics in Practice, und Difference Gel Electrophoresis. Heute berät er Firmen aus dem Umfeld der Elektrophorese und gibt Schulungen zum Thema.
Geleitwort XV
Vorwort XVII
Vorwort zur ersten Auflage XIX
Abkürzungen XXI
Teil I Grundlagen 1
1 Elektrophorese 7
1.1 Allgemeines 7
1.1.1 Elektrophoresen in freier Lösung 7
1.1.2 Elektrophoresen in stabilisierenden Medien 11
1.1.3 Gelelektrophorese 12
1.1.4 Stromversorger 20
1.1.5 Trennkammern 20
1.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen 25
1.2.1 Agarosegelelektrophorese 25
1.2.2 Polyacrylamidgelelektrophorese von niedermolekularen Substanzen 27
1.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen 28
1.3.1 Der Ferguson-Plot 28
1.3.2 Agarosegelelektrophorese 29
1.3.3 Polyacrylamidgelelektrophorese von Nukleinsäuren 31
1.3.4 Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen 34
Literatur 48
2 Isotachophorese 53
2.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit 55
2.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette ion train 55
2.3 Zonenschärfungseffekt 55
2.4 Konzentrationsregulierungseffekt 56
Literatur 57
3 Isoelektrische Fokussierung 59
3.1 Prinzip 59
3.2 Gele für die IEF 61
3.2.1 Polyacrylamidgele 61
3.2.2 Agarosegele 63
3.3 Temperatur 64
3.4 Kontrolle des pH-Gradienten 64
3.5 Arten von pH-Gradienten 65
3.5.1 Freie Trägerampholyten 65
3.5.2 Immobilisierte pH-Gradienten 69
3.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung 72
3.7 Titrationskurvenanalyse 73
Literatur 75
4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 79
4.1 IEF in IPG-Streifen 79
4.1.1 Streifengeometrie 80
4.1.2 pH-Gradienten 80
4.1.3 Einfluss von Salzen 80
4.1.4 Basische pH-Gradienten 81
4.1.5 Rehydratisieren von IPG-Streifen 82
4.1.6 Probenaufgabe 85
4.1.7 IEF-Bedingungen 87
4.1.8 Instrumentierung 88
4.2 SDS-PAGE 90
4.2.1 Äquilibrieren der IPG-Streifen 90
4.2.2 TechnischeKonzepte für die zweite Dimension (SDS-PAGE) 91
4.2.3 Geltypen 93
4.2.4 Gelherstellung 94
4.2.5 Durchführung der SDS-Elektrophorese 97
4.3 Proteomik 99
Literatur 99
5 Proteinprobenvorbereitung 103
5.1 Proteinquantifizierungsmethoden 103
5.2 Vorbereitung von nativen Proben 104
5.3 Proben für die SDS-Elektrophorese 105
5.3.1 SDS-Behandlung 105
5.3.2 Aufreinigung und Proteinanreicherung 109
5.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE 110
5.4.1 Waschen von Zellen 111
5.4.2 Zellaufschluss 111
Inhaltsverzeichnis VII
5.4.3 Probennahme und -aufbewahrung 112
5.4.4 Inaktivierung von Proteasen 114
5.4.5 Inaktivierung von Phosphatasen 114
5.4.6 Alkalische Bedingungen 114
5.4.7 Entfernung von störenden Substanzen 115
5.4.8 Vorfraktionierung 116
5.4.9 Spezialfall: Pflanzenproteine 117
Literatur 118
6 Proteindetektion 121
6.1 Fixierung 121
6.1.1 IEF-Gele 121
6.1.2 Agarosegele 122
6.1.3 SDS-Polyacrylamidgele 122
6.2 Färbungen nach der Elektrophorese 122
6.2.1 Organische Farbstoffe 122
6.2.2 Silberfärbung 123
6.2.3 Negativfärbung 125
6.2.4 Fluoreszenzfärbung 126
6.2.5 Spezifische Detektion 127
6.2.6 Visualisierung ohne Färbung 128
6.3 Proteinmarkierung 129
6.3.1 Proteinmarkierung mit Fluorophoren 129
6.3.2 Radioaktive Markierung von lebenden Zellen 130
6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE) 130
6.4.1 Minimal-Lysinmarkierung 131
6.4.2 Sättigung-Cysteinmarkierung 133
6.4.3 Der interne Standard 134
6.4.4 Planung eines Experiments 134
6.4.5 Die wichtigsten Vorteile von 2-D-DIGE 134
6.4.6 Vergleichende Fluoreszenzgelelektrophorese 135
6.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken 136
6.5.1 Gehaltsbestimmungen 136
6.5.2 Bildaufzeichnungssysteme 138
6.5.3 Bildanalyse 141
6.5.4 Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen 144
Literatur 146
7 Blotting 151
7.1 Transfermethoden 151
7.1.1 Diffusions-Blotting 151
7.1.2 Kapillar-Blotting 152
7.1.3 Press-Blotting 153
7.1.4 Vakuum-Blotting 153
7.1.5 Elektrophoretisches Blotting 154
7.2 Blotmembranen 157
7.3 Puffer für elektrophoretische Transfers 158
7.3.1 Proteine 158
7.3.2 Nukleinsäuren 160
7.4 Allgemeine Anfärbung 160
7.5 Blockieren 161
7.6 Spezialdetektion 161
7.6.1 Hybridisierung 161
7.6.2 Enzym-Blotting 162
7.6.3 Immun-Blotting 162
7.6.4 Lektin-Blotting 165
7.6.5 Stripping,Mehrfachanalyse 166
7.6.6 Doppel-Blotting 166
7.7 Proteinsequenzierung 166
7.8 Transferprobleme 166
7.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen 167
Literatur 169
Teil II Praktische Methodenanleitungen Ausrüstung und Methoden 173
Methode 1 PAGE von Farbstoffen 183
M1.1 Probenvorbereitung 183
M1.2 Stammlösungen 183
M1.3 Vorbereitung der Gießkassette 184
M1.3.1 Dichtung 184
M1.3.2 Slotformer 184
M1.3.3 Zusammenbau der Gießkassette 185
M1.4 Gießen der ultradünnen Gele 187
M1.5 Elektrophoretische Trennung 187
M1.5.1 Entnahme des Gels aus der Kassette 187
Methode 2 Agarose- und Immunelektrophoresen 191
M2.1 Probenvorbereitung 191
M2.2 Stammlösungen 192
M2.3 Herstellung der Gele 192
M2.3.1 Agarosegelelektrophorese 192
M2.3.2 Immunelektrophoresegele 194
M2.4 Elektrophoresen 198
M2.4.1 Grabar-Williams-Technik 199
M2.4.2 Laurell-Technik 199
M2.5 Proteinnachweis 200
M2.5.1 Coomassie-Färbung (Agaroseelektrophorese) 200
M2.5.2 Immunfixation der Agaroseelektrophorese 200
M2.5.3 Coomassie-Färbung (Immunelektrophoresen) 201
M2.5.4 Silberfärbung 202
Literatur 202
Methode 3 Titrationskurvenanalyse 203
M3.1 Probenvorbereitung 203
M3.2 Stammlösungen 203
M3.3 Herstellung der leeren Gele 204
M3.3.1 Vorbereitung der Gießform 204
M3.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 205
M3.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 207
M3.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 207
M3.4 Titrationskurvenelektrophorese 209
M3.4.1 Erzeugung des pH-Gradienten (Lauf ohne Probe) 209
M3.4.2 Nativelektrophorese im pH-Spektrum 210
M3.5 Coomassie- und Silberfärbung 210
M3.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 210
M3.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 211
M3.5.3 Fünf-Minuten-Silberfärbung getrockneter Gele 211
M3.6 Interpretation der Kurven 212
Literatur 214
Methode 4 Native PAGE in amphoteren Puffern 215
M4.1 Probenvorbereitung 216
M4.2 Stammlösungen 217
M4.3 Herstellung der leeren Gele 218
M4.3.1 Slotformer 218
M4.3.2 Zusammenbau der Gießkassette 219
M4.3.3 Polymerisationslösungen 220
M4.3.4 Befüllen der gekühlten Gelgießkassette 221
M4.3.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 221
M4.3.6 Waschen und Trocknen der Gele 222
M4.3.7 Quellen des Gels im amphoteren Puffer 222
M4.4 Elektrophorese 224
M4.5 Coomassie- und Silberfärbung 226
M4.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 226
M4.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 227
M4.5.3 Fünf-Minuten Silberfärbung getrockneter Gele 227
Literatur 228
Methode 5 Agarosegel-IEF 231
M5.1 Probenvorbereitung 231
M5.2 Herstellung des Agarosegels 232
M5.2.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 232
M5.2.2 Zusammenbau der Gelkassette 232
M5.2.3 Herstellung der Agaroselösung (0,8% Agarose) 233
M5.3 Isoelektrische Fokussierung 235
M5.3.1 Herstellung der Elektrodenlösungen 235
M5.4 Proteinnachweis 237
M5.4.1 Coomassie-Blau-Färbung 237
M5.4.2 Immunfixation 237
M5.4.3 Silberfärbung 238
Literatur 239
Methode 6 PAGIEF in rehydratisierten Gelen 241
M6.1 Probenvorbereitung 241
M6.2 Stammlösungen 241
M6.3 Herstellung der leeren Gele 242
M6.3.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 242
M6.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 242
M6.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 243
M6.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 244
M6.3.5 Waschen des Gels 244
M6.3.6 Trocknen des Gels 245
M6.4 Isoelektrische Fokussierung 245
M6.4.1 Rehydratisierlösung (Servalyt, Pharmalyte) 245
M6.4.2 Quellen des Gels 245
M6.4.3 Proteintrennung 246
M6.4.4 Probenaufgabe 247
M6.5 Coomassie- und Silberfärbung 248
M6.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 248
M6.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 249
M6.5.3 Die empfindlichste Silberfärbung für die IEF 249
M6.6 Methodischer Ausblick 251
Literatur 253
Methode 7 Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese 255
M7.1 Probenvorbereitung 255
M7.1.1 Nicht reduzierende SDS-Behandlung 255
M7.1.2 Reduzierende SDS-Behandlung 256
M7.1.3 Reduzierende SDS-Behandlungmit Alkylierung 257
M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 257
M7.2.1 Markierung 257
M7.2.2 Detektion 258
M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 258
M7.4 Vorbereitung der Gießkassette 259
M7.4.1 Herstellen des Slotformers 259
M7.4.2 Zusammenbau der Gießkassette 260
M7.5 Gradienten-Gel 261
M7.5.1 Gießen des Gradientengels 261
M7.6 Elektrophorese 265
M7.6.1 Vorbereitung der Trennkammer 265
M7.6.2 Entnahme des Gels aus der Kassette 265
M7.6.3 Platzierung auf der Kühlplatte 265
M7.6.4 Elektrophorese 267
M7.7 Coomassie- und Silberfärbung 267
M7.7.1 Heiße Coomassie-Färbung 267
M7.7.2 Kolloidalfärbung 268
M7.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 269
M7.7.4 Silberfärbung 270
M7.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 270
M7.8 Blotting 271
M7.9 Methodischer Ausblick 272
M7.9.1 SDS-Elektrophorese in gewaschenen und rehydratisierten Gelen 272
M7.9.2 Trennung von Peptiden 273
Literatur 274
Methode 8 Vertikale PAGE 275
M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung 276
M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE 277
M8.3 Gießen von Einzelgelen 278
M8.3.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 278
M8.3.2 Gradientengele 279
M8.4 Gießen vonMehrfachgelen 281
M8.4.1 Multiple diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 282
M8.4.2 Multiple SDS-Polyacrylamidgradientengele 283
M8.5 Elektrophorese 286
M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden 288
M8.6.1 Stammlösungen 288
M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese 289
M8.8 DNA-Elektrophorese 290
M8.9 Langzeitstabile Gele 291
M8.10 Proteindetektion 291
M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan 292
M8.11.1 Beschichten einer Glasplatte mit Bind-Silan 292
M8.11.2 Entfernen von Gel und Bind-Silan von einer Glasplatte 293
Literatur 293
Methode 9 Blau-Nativ-PAGE 295
M9.1 Solubilisierung 295
M9.2 Stammlösungen 296
M9.3 Gießen der Gele 297
M9.4 Elektrophorese 299
Literatur 300
Methode 10 Semidry-Blotting von Proteinen 301
M10.1 Transferpuffer 303
M10.1.1 Kontinuierliches Puffersystem 303
M10.1.2 Diskontinuierliches Puffersystem 303
M10.1.3 Transfers aus Agarosegelen 304
M10.2 Technische Durchführung 304
M10.2.1 Gele ohne Trägerfolie 305
M10.2.2 Trägerfoliengebundene Gele 306
M10.2.3 Bei Verwendung von Nitrocellulose (NC)-Membran 306
M10.2.4 Bei Verwendung einer PVDF-Membran 307
M10.2.5 Proteintransfer aus den abgeschnittenen Gelen 308
M10.3 Färbung von Blotfolien 309
M10.3.1 Amidoschwarzfärbung 309
M10.3.2 Reversible Färbung 309
M10.3.3 Indian-Ink-Färbung 310
Literatur 311
Methode 11 IEF im immobilisierten pH-Gradienten 313
M11.1 Probenvorbereitung 314
M11.2 Stammlösungen 314
M11.3 Immobilinerezepturen 315
M11.3.1 Maßgeschneiderte pH-Gradienten 315
M11.4 Vorbereitung der Gießkassette 318
M11.4.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 318
M11.4.2 Zusammenbau der Gelkassette 319
M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele 320
M11.5.1 Gießen des Gradienten 321
M11.6 Isoelektrische Fokussierung 327
M11.6.1 Probenaufgabe 327
M11.6.2 Elektrodenlösungen 328
M11.6.3 Fokussierungsbedingungen 328
M11.6.4 Messung des pH-Gradienten 329
M11.7 Coomassie- und Silberfärbung 329
M11.7.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 329
M11.7.2 Acid-Violet-17-Färbung 330
M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung 331
Literatur 332
Methode 12 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 333
M12.1 Probenvorbereitung 334
M12.1.1 Probenaufreinigung 335
M12.1.2 Wichtige Hinweise zur kompletten Resolubilisierung der Pellets 335
M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 338
M12.2.1 Markierung einer Probe 338
M12.2.2 Detektion 338
M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 339
M12.4 Gelherstellung 340
M12.4.1 IPG-Streifen 340
M12.5 SDS-Porengradientengele 344
M12.6 Trennbedingungen 346
M12.6.1 Erste Dimension (IPG-IEF) 346
M12.6.2 Äquilibrieren 351
M12.6.3 Zweite Dimension (SDS-Elektrophorese) 352
M12.7 Proteindetektion 356
M12.7.1 Färben von multiplen Gelen 356
M12.7.2 Kolloidalfärbung 358
M12.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 358
M12.7.4 Silberfärbung 359
M12.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 360
Literatur 361
Methode 13 Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE) 365
M13.1 Planung eines Experiments 365
M13.2 Probenvorbereitung 366
M13.2.1 Solubilisierung von DIGE-Proben 366
M13.2.2 Rekonstituierung der CyDyes 367
M13.2.3 Für Minimalmarkierung der Lysine 367
M13.2.4 Für Sättigungsmarkierung der Cysteine 368
M13.3 DIGE-Markierung 368
M13.3.1 Minimalmarkierung der Lysine 368
M13.3.2 Sättigungsmarkierung der Cysteine 369
M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen 371
M13.5 Detektion der DIGE-Spots 371
Literatur 372
Methode 14 PAGE von DNA-Fragmenten 373
M14.1 Stammlösungen 374
M14.1.1 Puffersystem I (Tris-Acetat/Tris-Tricin) 374
M14.1.2 Puffersystem II (Tris-Phosphat/TBE) 375
M14.2 Herstellung der Gele 375
M14.2.1 Vorbereitung der Gießkassette 375
M14.2.2 Herstellen des Slotformers 376
M14.2.3 Zusammenbau der Gießkassette 377
M14.2.4 Befüllen der Gelgießkassetten 378
M14.2.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 379
M14.2.6 Waschen und Trocknen der Gele 379
M14.3 Probenvorbereitung 379
M14.3.1 PCR-Produkte generell 379
M14.3.2 SSCP-Proben 380
M14.4 Elektrophorese 381
M14.4.1 Anquellen von gewaschenen und getrockneten Gelen 381
M14.4.2 Vorbereitung der Elektrodendochte 383
M14.4.3 Entnahme des Gels aus der Kassette 383
M14.4.4 Platzierung auf der Kühlplatte 384
M14.4.5 Probenaufgabe und Elektrophorese 385
M14.5 Silberfärbung 386
Anhang A Problemlösungen 389
A.1 Häufige Fehler 389
A.2 Isoelektrische Fokussierung 392
A.2.1 PAGIEF mit Trägerampholyten 392
A.2.2 Agarosegel-IEF mit Trägerampholyten 401
A.2.3 Immobilisierte pH-Gradienten 406
A.3 SDS-Elektrophorese 413
A.3.1 Horizontale SDS PAGE 413
A.3.2 Vertikale PAGE 422
A.4 Zweidimensional-Elektrophorese 425
A.5 Semidry-Blotting 433
A.6 PAGE von DNA-Fragmenten 440
Literatur 443
Stichwortverzeichnis 445
